Вирус гриппа h3n2 или гонконг

Вирус гриппа h3n2 или гонконг

Изобретение относится к вирусологии и представляет собой штамм вируса гриппа А птиц. В отличие от других штаммов с подтипом гемоглютинина Н5 предложенный штамм является непатогенным для птиц и людей. Адаптированный штамм получен в результате пассажей исходного вируса А/утка кряква/Пенсильвания/10218/84(H5N2) через легкие белых мышей. Полученный штамм предназначен для изучения генетических основ преодоления межвидового барьера, выявления филогенетических и экологических связей вирусов, выделенных в разное время, в различных географических регионах. Поражения легких мышей, вызываемые заявленным вирусом гриппа, представляют собой вирусную бронхопневмонию, похожую во многих отношениях на вирусную бронхопневмонию у человека. Штамм вируса гриппа А (H5N2) птиц хранится в коллекции лаборатории музейных штаммов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН — ГКВ, под номером 2340. 3 табл. Изобретение относится к вирусологии и представляет собой штамм вируса гриппа А птиц (А/утка кряква/Пенсильвания/10218/84 (H5N2)), адаптированный к размножению в легких мышей и вызывающий у мышей манифестную инфекцию, регистрируемую по клиническим, патологоанатомическим, вирусологическим и серологическим показателям. Вирусы гриппа A вызывают заболевания не только у человека, но и у многих видов домашних и диких птиц, свиней, лошадей, китов и других млекопитающих. Основным природным источником вирусов гриппа А являются дикие водоплавающие птицы. Согласно зооантропонозной теории происхождения пандемических штаммов вируса гриппа А они могут возникать в результате генетической реассортации в природе и последующей реинтродукции вируса в человеческую популяцию. Однако возможна и прямая передача птичьих вирусов гриппа человеку. Локальная вспышка гриппа среди людей в 1997 году в Гонконге, характеризовавшаяся высоким процентом смертности, вызванная вирусом гриппа А птиц с антигенным подтипом гемагглютинина H5, четко доказала возможность такого пути передачи [1] . Вирус, вызвавший эту вспышку, не передавался эффективно от человека к человеку, но такой факт прямой трансмиссии вируса от птиц к человеку обратил внимание исследователей на вирусы гриппа А с подтипом гемагглютинина H5, как на потенциально возможного возбудителя пандемии гриппа [2]. Это указывает на важность и необходимость экологических наблюдений и выявления штаммов вируса гриппа А животных и птиц, обладающих наибольшей потенциальной возможностью внедриться в человеческую популяцию. Потенциальную возможность внедрения вирусов гриппа с подтипом гемагглютинина H5 следует также учитывать при разработке антигриппозных вакцин, антител и сывороток широкого спектра действия, скрининге новых фармакологически активных веществ. Известно, что в естественных условиях мыши резистентны к инфицированию вирусами гриппа. В настоящее время известны штаммы вируса гриппа А человека, вызывающую летальную пневмонию у мышей — A/WSN/33 (H1N1) [3], А/СССР/90/77 (H1N1) [4], A/FM/1/47 (H1N1) [5], A/Aichi/2/68 (H3N2) [6], A/Philippines/82 (H3N2) [7] , А/Япония/305/57 (H2N1) [8] и один птичий штамм А/черная утка/Нью-Джерси/1580/78 (H2N3) [9] . Наиболее известным является штамм A/Aichi/2/68, прошедший более 100 пассажей через легкие мышей и обладающий высокой пневмовирулентностью. Вирулентные для мышей штаммы используются как для решения задач практического здравоохранения (определение протективных свойств при отборе кандидатов в вакцинные штаммы), так и в научных исследованиях (изучение патогенеза гриппозной инфекции). Указанные выше вирусы, вызывающие гриппозную инфекцию у мышей, представляют собой штаммы вируса гриппа А с гемагглютинином подтипа H1, H2 или H3. Цель изобретения — получение вирулентного для мышей штамма вируса гриппа, пригодного для моделирования экспериментальной гриппозной инфекции. Заявляемый штамм А/утка кряква/ Пенсильвания/10218/84 (H5N2) сходен с вышеперечисленными аналогами, но по существу представляет собой новый, оригинальный в антигенном отношении вирус. Штамм относится к вирусам гриппа А с гемагглютинином подтипа H5. К преимуществам данного штамма, несомненно, относится то, что в отличие от других штаммов с подтипом гемагглютинина H5, вызывающих летальную системную инфекцию у птиц, исходный, непатогенный для мышей вирус, также непатогенен для птиц и людей. Работа с адаптированным к мышам вирусом не требует повышенных мер безопасности, которые требуются для работы с высоко патогенными птичьими вирусами с подтипом гемагглютинина H5. Полученный штамм целесообразно использовать для решения научных задач, в частности: изучения генетических основ преодоления межвидового барьера (адаптации вирусов к новому хозяину), выявления филогенетических и экологических связей вирусов, выделенных в разное время, в различных географических регионах. До момента внедрения научных результатов в практику необходимо проведение опытов на лабораторных моделях, позволяющих отобрать кандидатов, соответствующих критериям для вакцинных штаммов, охарактеризовать протективные свойства, изучить антивирусную активность и дозировку фармакологически активных веществ. Для этих целей необходимы чувствительные к гриппозной инфекции экспериментальные лабораторные модели и вирусы гриппа, способные размножаться в организме восприимчивого хозяина. Широкое практическое использование мышей, их низкая стоимость допускают такие лабораторные исследования, которые были бы невозможны при использовании более редких и дорогих животных, например хорьков, обезьян. Поражения легких мышей, вызываемые заявляемым вирусом гриппа, представляют собой вирусную бронхопневмонию, похожую во многих отношениях на вирусную бронхопневмонию у человека. Получение штамма. Адаптированный штамм получен в результате 23 последовательных пассажей исходного вируса А/утка кряква/Пенсильвания/10218/84 (H5N2) через легкие белых мышей массой 8-10 г при интраназальном заражении. Для первичного инфицирования в качестве исходного материала использовали не разведенную вируссодержащую аллантоисную жидкость, в дальнейших пассажах — 10% суспензию легких мышей, забитых через 48 часов после заражения. Адаптированный к мышам вирус был изолирован из легочной суспензии, полученной от 23 пассажа, одним пассажем на куриных эмбрионах. Предлагаемый штамм обладает всеми признаками и характеристиками вируса гриппа А и хранится в коллекции лаборатории музейных штаммов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН. Штамм характеризуется следующими морфологическими, биологическими и антигенными свойствами:
Морфологические признаки. При электронно-микроскопическом исследовании негативно-контрастированных препаратов в популяции адаптированного к мышам штамма обнаруживаются вирионы гриппа стандартной сферической формы со средним диаметром 80-120 нм (51,5%). Имеются также филаментозные формы (37,0%) и гигантские сферические частицы (11,5%). Популяция исходного штамма содержит 51,0% вирионов стандартной сферической формы, 43,0% филаментозных форм и 6,0% гигантских сферических частиц (табл. 1). При отсутствии значимых различий в соотношении различных форм вирионов в популяции вирионы адаптированного к мышам штамма А/утка кряква/Пенсильвания/10218/84 отличались от исходного штамма меньшей плотностью оболочки: очертания вирионов адаптированного штамма на электронных микрофотографиях были менее четкими по сравнению с родительским штаммом. Биологические свойства. Исходный вирус размножался в легких мышей, не вызывая заболевания, в низких титрах (2,25 lg ЭИД50/0,2 мл). Однако в ходе пассирования происходит селекция мутантов, приобретших способность размножаться в организме другого хозяина (мыши), при этом наблюдается изменение инфекционной активности. Инфекционный титр в легких мышей адаптированного штамма — 7,0 lg ЭИД50/0,2 мл. Антигенные свойства. По антигенной композиции гемагглютинина (определяемой в РТГА с поликлональными сыворотками) адаптированный штамм отличался от исходного. Отмечены различия в способности связываться с моноклональными антителами к гемагглютинину H5 CP22, CP34, CP46, CP55, CP58 и CP79 (табл. 2). Патогенность для мышей. Исходный штамм не вызывает у мышей никаких признаков заболевания. Адаптированный вирус вызывает выраженные патологические изменения в легких, а также гибель мышей в течение 15 суток наблюдения. 50% гибели животных отмечали при интраназальном введении 0,1 мл вируса в разведении 10-6,0 , т. е. lg ЛД50 = 6,0. Вирулентность адаптированного к мышам штамма, рассчитанная как отношение lg ЭИД50/lg ЛД50 равна 1,75. Физико-химические свойства. При исследовании электрофоретической подвижности вирусных белков в ПААГе не обнаружено различий между адаптированным и исходным штаммами. Первичная структура гемагглютинина. Нуклеотидное секвенирование гена гемагглютинина адаптированного к мышам вируса и последующая трансляция аминокислотной последовательности выявили три аминокислотные замены в позициях 203 (Ser—> Phe), 273 (Glu—>Gly) и 320 (Leu—> Pro) (нумерация согласно гемагглютинину подтипа H3) (табл. 3). Заявляемый штамм предлагается использовать для изучения протективных свойств вирусов гриппа А с гемагглютинином подтипа H5. В этом случае после иммунизации мышей препаратами инактивированного вируса интраназально вводят адаптированный штамм А/утка кряква/Пенсильвания/10218/84 и определяют уровень защиты. Таким образом, предлагаемый штамм А/утка кряква/Пенсильвания/10218/84 сходен по способу получения с другими вирулентными для мышей штаммами, однако обладает важной особенностью — он относится к другому антигенному подтипу гемагглютинина (H5). Использование предлагаемого штамма позволит изучать перекрестные протективные свойства вирусов с H5 подтипом гемагглютинина, а также действие защитных и терапевтических препаратов против бронхопневмонии, вызванной вирусом гриппа А с подтипом гемагглютинина H5. Адаптированный к мышам штамм А/утка кряква/Пенсильвания/10218/84 наряду с вирусами гриппа А с гемагглютинином H1, H2 и H3 может быть использован для экологических наблюдений над вирусами гриппа А и моделирования гриппозной инфекции. Пример. Для определения протективных свойств различных штаммов вирусов гриппа А с гемагглютинином подтипа H5, изолированных от птиц и человека, был использован заявляемый адаптированный к мышам штамм вируса гриппа А/утка кряква/Пенсильвания/10218/84 (H5N2). Беспородных белых мышей массой 8-10 г (от 18 до 24 животных в каждой группе) иммунизировали инактивированными препаратами вирусов гриппа А (H5). Использовали птичьи штаммы А/крачка/Южная Африка/1/61 (H5N3), А/камнешарка/Делавар/244/91 (H5N2), А/утка кряква/Пенсильвания/10218/84 (H5N2) (адаптированный вирус в качестве контроля), А/утка/Хошимин/014/78 (H5N3) и человеческий штамм А/Гонконг/156/97 (H2N1). Инактивацию проводили штамм вируса гриппа а /h5n2/ гкв № 2340 птиц для   моделирования гриппозной инфекции, патент № 2163637-пропиолактоном (0,015 М конечная концентрация). Каждое животное получило 20 мкг белка инактивированного препарата. Контрольная группа животных получила плацебо — смесь адьюванта и физиологического раствора. Через 21 сутки после иммунизации мышам под эфирным наркозом интраназально вводили по 50 мкл патогенного для них штамма А/утка кряква/Пенсильвания/10218/84 (H5N2) в дозе 10 ЛД50. Гибель мышей регистрировали в течение 10 дней после заражения, затем высчитывали % выживаемости животных. В контрольной группе животных выживаемость составила 14,28%. В остальных группах эти показатели составили: 50% для штамма А/крачка/Южная Африка/1/61 (H5N3), 94,4% для А/камнешарка/Делавар/244/91 (H5N2), 100% для А/утка кряква/Пенсильвания/10218/84 (H5N2), 55,5% для А/утка/Хошимин/014/78 (H5N3) и 55,5% для вируса А/Гонконг/156/97 (H2N1). Сравнительный анализ полученных данных о степени защиты экспериментальных животных, получавших препараты различных вирусов гриппа А (H5), позволяют судить о перекрестных протективных свойствах вирусов. Суммарный анализ этих данных, а также данных об антигенной специфичности гемагглютинина и его первичной структуры позволяет выявить различные филогенетические группы среди вирусов гриппа А с подтипом гемагглютинина H5, что должно учитываться при отборе вирусов — потенциальных кандидатов в вакцинные штаммы. Сущность изобретения заключается в том, что получен новый штамм вируса гриппа A (H5N2) птиц, способный размножаться в легких мышей и вызывать у них летальную бронхопневмонию и относящийся к антигенному подтипу гемагглютинина H5. Таким образом, заявляемый штамм пригоден для определения протективных свойств вирусов гриппа А, изолированных как от птиц, так и от людей, изучения эффективности моноклональных антител, генно-инженерных вакцин и противовирусных препаратов. Также возможно его использование для экологических наблюдений над вирусами гриппа А, предусматривающее моделирование экспериментальной гриппозной инфекции. Список цитируемой литературы. 1. Jong JC de et al., (1997), Nature 389, 554. 2. Claas ECJ et al., (1998), Lancet 353, 472-477. 3. Ward AC, (1995), Archives of Virology 140, 383-389. 4. Gitelman AK et al., (1984), Virology 134, 330-332. 5. Brown EG, (1990), Journal of Virology 64, 4523-4533. 6. Rudneva IA et al., (1986), Archives of Virology 90, 237-248. 7. Hartley CA et al., (1997), Archives of Virology 142, 75-88. 8. Govorkova EA, Smirnov YA (1997), Acta Virologica 41, 251-257. 9. Lipatov AS et al., (1995), Acta Virologica 39, 279-281.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Штамм вируса гриппа А (Н5N2) птиц ГКВ N 2340 для моделирования гриппозной инфекции.

Source: www.freepatent.ru

Читайте также

Добавить комментарий